MEGOSZTÁS | NYOMTATÁS | EMAIL
Szeretnék egy olyan emlékeztetővel kezdeni, ami gyakran elveszik a nyilvános vitákban: A Covid mRNS vakcinák valóban újszerű orvostechnikai termékek.
A 2020-as sürgősségi engedélyezés előtt az mRNS vakcinatechnológiát soha nem alkalmazták nagy mennyiségben embereken. Mindössze két klinikai vizsgálatban, az egyikben a Pfizer-BioNTech, a másikban a Moderna tesztelte ezt a platformot embereken. Összesen nagyjából 37 000 ember kapott valaha mRNS vakcinát az orvostudomány történetében (nem számítva a veszettség, a CMV és a rák elleni vakcinákkal kapcsolatos korábbi tapasztalatokat, amelyek sokkal kisebb, korai fázisú vizsgálatokra korlátozódtak). Ez nem kritika, hanem egyszerűen egy ténymegállapítás. De azt jelenti, hogy ezeknek a termékeknek a hosszú távú biztonságossági profilja hiányosan ismert volt, és továbbra is hiányosan ismert.
A következő szinte minden molekuláris biológus számára ismerős. Bonyolult, de a tétre való tekintettel megpróbálom leegyszerűsíteni. Fontos, hogy mindenki számára világosan elmagyarázzuk a molekuláris keretrendszert, mert az, hogy hogyan készülnek ezek a vakcinák, közvetlenül meghatározza, hogy mi van az ampullában.. És ami az injekciós üvegben van, miután beadták, az az egész testben szétterjed, és események sorozatát indítja el, amelyek hosszú távú egészségügyi következményekkel járhatnak.
Az in vitro transzkripció nem csupán gyártási részlet
A módosított mRNS-vakcinákat in vitro transzkripciónak (IVT) nevezett eljárással állítják elő.)Az IVT az a módszer, amellyel a módosított mRNS-t szintetizálják, amely végül a vakcina hatóanyagává válik.
Ez nem egy triviális technikai részlet. Az IVT alapvetően formálja a végtermék molekuláris összetételét.
A BioNTech tudósai, beleértve a Pfizer vakcina fejlesztésében közvetlenül részt vevőket is, részletes áttekintést tettek közzé.1 leírja, hogyan keletkeznek az IVT-reakciók nemcsak a kívánt teljes hosszúságú mRNS-t, hanem számos mellékterméket és szennyeződést is, hogyan távolítják el ezeket jellemzően, és milyen biológiai következményekkel járhatnak, ha fennmaradnak. Ezeket a gyártási irányokat és az általuk létrehozott melléktermékeket a Moderna is részletesen ismertette szabadalmaiban (US10 653 712 B2 és US10 077 439 B2). De ami még fontosabb, ez a molekuláris biológia már jóval a Covid előtt jól megalapozott volt. Mindez nem spekuláció.
A kiindulási anyag: DNS-sablonok
Lényegében az IVT-reakció a kívánt fehérjét kódoló kétszálú DNS-sel kezdődik. Ebben az esetben a SARS-CoV-2 tüskefehérjéjével.
Az mRNS vakcinákban használt tüskét kódoló szekvencia a következő: genetikailag módosított a stabilitás és a sejtes tolerancia javítása érdekében, beleértve két aminosav-szubsztitúciót, amelyek megkülönböztetik a vírusos tüskétől. Ez a módosítás szándékos.
Maga a DNS-sablon különböző formákat ölthet. A Pfizer korai klinikai vizsgálatai során PCR-rel előállított DNS-fragmentumokat használtak. A kereskedelmi gyártási folyamat azonban plazmidokból származó DNS-re támaszkodott. Ez azért fontos, mert a plazmidok további szabályozó szekvenciákat tartalmaznak. A Pfizer esetében ezek olyan elemeket tartalmaznak, mint az SV40 promoter és az ori szekvenciák, amelyek aggályokat vetnek fel, ha bejutnak az emberi sejtekbe.
Miután ezt a DNS-sablont hozzáadtuk az IVT-reakcióhoz, az RNS-polimerázzal és más komponensekkel együtt mRNS-sé íródik át (1. ábra).
Az IVT tervezéssel állít elő melléktermékeket
Bár az IVT kívánt kimenete a tervezett teljes hosszúságú mRNS-termék, a tényleges kimenet összetettebb. Ezek közé tartoznak különféle melléktermékek (1) különféle RNS-fajták, beleértve a kétszálú RNS-t (dsRNS), (2) RNS-hez kapcsolt DNS-t (RNS-DNS hibridek) és (3) az eredeti templátból származó szabad DNS-t (2. ábra).
Ezen melléktermékek képződése jól dokumentált és elkerülhetetlen, ezért a további tisztítás elengedhetetlen a biztonság érdekében.
2. ábra. Az IVT gyártásának melléktermékei és szennyező anyagai. A kép forrása: 1.
A tisztításnak ismert korlátai vannak
A gyártás után két tisztítási lépésre van szükség: először a DNS, majd az RNS melléktermékek eltávolítására (3. ábra):
3. ábra. IVT melléktermékek eltávolítása. A kép forrása: 2.
A DNS eltávolításához egy DNáz I nevű enzimet adnak a reakcióelegyhez, amelyet általában a szennyező DNS lebontására használnak. Bár a DNáz I hatékony a szabad templát DNS-sel szemben, több tanulmány, beleértve maguknak a BioNTech tudósainak a munkáit is, azt mutatja, hogy a DNáz I nem hatékony az RNS-hez kapcsolódó DNS (RNS-DNS hibridek) eltávolításában.
Ez a korlátozás nem vitatott, a szakirodalomban dokumentálva van.
Amit független elemzések mutattak ki
Ez a kontextus kulcsfontosságú a kész vakcinafiolák legújabb független elemzéseinek értelmezéséhez.
Kutatók3 és szabályozók4 arról számoltak be, hogy gyakorlatilag minden tesztelt fiolában DNS-szennyeződéseket észleltek. Ezek a szennyező anyagok tartalmaztak mind kétszálú DNS-t, mind RNS-DNS hibrideket, amelyek rezisztensnek tűntek a DNáz I emésztéssel szemben.
Néhány mintában a tüskéket kódoló DNS több mint 100-szor magasabb szinten volt jelen, mint más plazmidszekvenciákban.5, ami egyenetlen vagy hiányos emésztésre utal. A szekvenálás és a kvantitatív PCR-elemzések további, átlagosan ~200 bázispár hosszúságú DNS-fragmentumokat mutattak ki, némelyik meghaladta a 4 kilobázist. Több esetben a teljes plazmidra kiterjedő szekvenciákat figyeltek meg.
Összefoglalva, ezek az eredmények komoly kérdéseket vetnek fel a tisztítás következetességével és teljességével kapcsolatban a nagyméretű gyártás során, valamint a maradék nukleinsavak lehetséges biológiai következményeivel kapcsolatban az emberekben.
Miért fontosak biológiailag a nukleinsav-szennyeződések?
Az RNS és a DNS a veleszületett immunrendszer hatékony aktivátorai. Ez nem spekuláció. A mintázatfelismerő receptorok és a cGAS-STING útvonal erőteljesen reagálnak az idegen nukleinsavakra, gyulladást, növekedésgátlást és akár sejthalált is kiváltva.
Pontosan ezek a mechanizmusok az oka annak, hogy a génterápiás termékeket szigorú biztonsági felügyeletnek vetik alá.
Ironikus módon a Covid mRNS vakcinákat kifejezetten azért módosították, hogy csökkentsék ezt az erős veleszületett immunaktivációt. Az RNS-DNS hibridek és DNS-fragmensek azonban ezen módosítások ellenére is erős immunválaszt váltanak ki.
A kitartás új kérdéseket vet fel
Jelentős bizonyítékok támasztják alá, hogy a tüske mRNS és fehérje hetekig, hónapokig, sőt évekig is fennmarad az emberi szövetekben a vakcináció után (1. táblázat).
Még nem tudjuk, hogy ez a perzisztencia a hosszan tartó mRNS-stabilitást, a folyamatos transzlációt vagy a DNS-alapú mechanizmusokat tükrözi-e. De a DNS-integráció valószínűségét és az izomsejtekben található hosszú élettartamú, nem integrálódott plazmid DNS-t figyelembe véve,6 Nem ésszerűtlen feltételezni, hogy a Spike mRNS, fehérje és a Spike elleni antitestek perzisztenciája évekkel a vakcináció után nem független a DNS-szennyeződésektől és a beoltott intravénás vénás trombózis (IVT) utáni melléktermékektől.
1. táblázat. A tüske mRNS és fehérje perzisztenciája emberekben vakcináció után
Rövid és hosszú távú biztonsági vonatkozások
Összességében ezek az adatok számos fontos biztonsági szempontot vetnek fel.
Először is, akut immunreakciókat, beleértve a citokinviharokat és az anafilaxiát, jelentettek közvetlenül a vakcinációt követően. Az ilyen erős gyulladásos válaszokat nem szabad egyenesen a szennyeződésekhez nem kapcsolódóként elutasítani, különösen a nukleinsavak által kiváltott immunaktivációról ismert információk alapján.
Másodszor, és ez még fontosabb, a hosszú távú kockázatok. A perzisztáló tüskeexpresszió valószínűsíthetően hozzájárulhat krónikus immun szindrómák kialakulásához. Még aggasztóbb a DNS-integráció lehetősége, amely az inszerciós mutagenezis vagy a génkárosodás kockázatát hordozza magában. Ez a rák vagy a fejlődési rendellenességek kockázatát jelenti attól függően, hogy a DNS hol és milyen korban integrálódott.
Figyelemre méltó, hogy maga az FDA is kijelenti tájékoztatóiban, hogy ezek a vakcinák nem... értékelték karcinogenitás (rákképződés) vagy genotoxicitás (DNS-károsodás) szempontjából, ami rutinszerű és elvárt szempont lenne a génterápia felügyelete során, ahol a hosszú távú monitorozás standard.
A DNS-sel kapcsolatos szabályozási hiányosságok az mRNS vakcinákban
Mivel már valóban nincs vita arról, hogy az mRNS-vakcinákban maradék DNS van-e, a kérdés az, hogy a jelenlegi irányelvek és biztonsági határértékek megfelelőek-e az mRNS-vakcinákra. Biztosítottak minket arról, hogy a DNS-melléktermékek a szabályozási irányelvekben meghatározott határértékeken belül vannak. Tehát mi az FDA iránymutatása a DNS-melléktermékekkel és szennyező anyagokkal kapcsolatban?
Az FDA leggyakrabban idézett, reziduális DNS-re vonatkozó irányelvét (≤10 ng adagonként) olyan vírusvakcinákra dolgozták ki, amelyeket élő, fragmentált és „csupasz” sejtekben állítottak elő, és amelyek korlátozottan képesek bejutni az emberi sejtekbe. Az mRNS-vakcinákat azonban nem sejtekben állítják elő, reziduális DNS-ük nem gazdasejtből származik, és ami a legfontosabb, az mRNS-vakcinákban lévő DNS nem csupasz. LNP-bejuttató rendszerekkel hozzák összefüggésbe, amelyek kifejezetten megkönnyítik a DNS bejutását a sejtekbe. Az FDA 2010-es irányelve egyértelművé teszi, hogy nem határoz meg releváns biztonsági küszöbértéket az LNP-alapú termékekhez kapcsolódó DNS-re vonatkozóan.
A másik gyakran idézett útmutató a WHO-tól származik rekombináns fehérjeterápiákra vonatkozóan, amelyek a monoklonális antitestekben vagy mesterségesen előállított sejtekben előállított hormonokban található reziduális DNS-t kezelik. Itt ismét a reziduális DNS gazdasejtekből vagy expressziós plazmidokból származik, nyomokban, nem kapszulázott DNSként (csupasz) van jelen, és a végtermék egy tisztított fehérje, nem pedig nukleinsav-alapú terápia (mRNS-vakcina). Tehát ez az útmutató nem vonatkozik az mRNS-vakcinákra.
Sem az FDA, sem a WHO leggyakrabban idézett szabályozási szabványai nem voltak érvényesek a reziduális DNS-re vonatkozóan. mRNS vakcinákhoz fejlesztették ki, és nem foglalkoznak közvetlenül ezzel a biztonsági problémával.
Mit mondott a WHO az mRNS vakcinákról – a bevetés után
2022-ben az Egészségügyi Világszervezet (WHO) kiadott egy útmutatót, amely kifejezetten az mRNS vakcinákra vonatkozik.7Figyelemre méltó, hogy ezt a dokumentumot kiadták után ezen termékek globális bevezetése. Konkrétan kijelenti, hogy ez az útmutató a következőkre adott válasz: „az új technológiával kapcsolatos biztonsági, gyártási és szabályozási kérdések.„A dokumentum több fontos kijelentést is tesz:
"Mivel a gyártáshoz használt módszerekről még nem állnak rendelkezésre részletes információk, a biztonságos és hatékony mRNS-vakcinák ellenőrzése még nem szabványosított, és bizonyos részletek továbbra is zártkörűek, így nyilvánosan nem elérhetők, jelenleg nem lehetséges konkrét nemzetközi irányelvek vagy ajánlások kidolgozása."
Továbbá kijelenti: „A részletes gyártási és ellenőrzési eljárásokat… meg kell vitatni és jóvá kell hagynia az NRA-nak [Nemzeti Szabályozó Hatóság].] egyedi eseti alapon."
A WHO elismeri, hogy az mRNS-vakcinák ellenőrzése még nem volt szabványosított, és hogy nem volt megvalósítható konkrét nemzetközi irányelvek vagy ajánlások kidolgozása. Továbbá a nemzeti hatóságok általi eseti értékeléshez szabályozói felügyeletre van szükség.
Ezt az mRNS vakcinák bevezetése után tették közzé..
És e Substack írásakor az FDA még mindig nem dolgozott ki szabványosított irányelveket az mRNS-vakcinákra, és nem szolgáltatott semmilyen bizonyítékot és biztonságossági adatot az mRNS-vakcinákban található DNS bármilyen korlátjának alátámasztására.
Végül, érdemes megismételni: bár az mRNS-technológia nem új keletű, a Covid előtt génterápiaként szabályozták, nem pedig hagyományos vakcinaként. A Covid-vakcinákban található DNS-melléktermékeket övező biztonsági kérdések minden mRNS-vakcinánál ugyanazok lesznek, beleértve az influenza, az RSV vagy akár a rák elleni mRNS-vakcinákat is.
Ez azért van, mert az mRNS-termékek alapvetően különböznek. Be kell jutniuk a sejtekbe, és utasítaniuk kell őket egy idegen fehérje termelésére. Ez eltér minden más hagyományos vakcinától, amely közvetlenül juttatja be a fehérjét. Erre a platformra nincs klinikai precedens, és az ismételt adagolásra sincs klinikai precedens. És biztosan nincs precedens populációs szinten.
Ebben a szakaszban, világjárvány hiányában, a felhalmozódó mechanisztikus adatok és klinikai megfigyelések, valamint a piacon megjelenő mRNS-vakcina termékek elterjedése miatt átláthatóságra és közvetlen együttműködésre van szükség a szabályozó hatóságok, különösen az FDA komoly biztonsági tanulmányaival kapcsolatban, amely kritikus irányelveket határoz meg ezen termékek gyártására – különösen a DNS-melléktermékek tekintetében.
Az új technológia újszerű vizsgálatot igényel – nem elhallgattatást, manipulációt vagy cenzúrát.
Referenciák
1 https://www.frontiersin.org/journals/molecular-biosciences/articles/10.3389/fmolb.2024.1426129/full
2 Webb C, Ip S és munkatársai Mol Pharm. 2022. április 4.;19(4):1047-1058. doi: 10.1021/
3 https://www.tandfonline.com/doi/10.1080/08916934.2025.2551517?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed
4 https://www.tga.gov.au/resources/publication/tga-laboratory-testing-reports/summary-report-residual-dna-and-endotoxin-covid-19-mrna-vaccines-conducted-tga-laboratories.
5 https://zenodo.org/records/17832183; https://www.scstatehouse.gov/CommitteeInfo/SenateMedicalAffairsCommittee/PandemicPreparedness/Phillip-Buckhaults-SC-Senate-09122023-final.pdf
6 Wang és munkatársai (2004) – „Plazmid DNS integrációjának kimutatása a gazda genomiális DNS-ébe intramuszkuláris injekció és elektroporáció után” (Gene Therapy, 2004). Egereknek csupasz plazmid DNS-t injektáltak intramuszkulárisan, majd elektroporációval fokozták a felvételt. Tisztított genomiális DNS-en végzett, nagy érzékenységű PCR-rel (gélszeparációval az extrakromoszómális formák eltávolítására) a szerzők négy független integrációs eseményt azonosítottak az injekció beadását követő 4 héttel. A csatlakozási szekvenálás megerősítette a véletlenszerű integrációs helyeket (nincsenek preferenciális hotspotok), ami összhangban van a nem homológ végcsatlakozással. Az integrációs gyakoriság alacsony volt, de mérhető. Ez az egyik legtisztább demonstrációja a tényleges spontán integrációs eseményeknek in vivo csupasz plazmid DNS izomban történő alkalmazásában. Megjegyzendő, hogy ez a tanulmány elektroporációval fokozott DNS-bejuttatást alkalmazott, amelyet össze lehetett hasonlítani az LNP-ken keresztüli fokozott bejuttatással.
Martin és munkatársai (1999) – „Plazmid DNS malária elleni vakcina: A genomiális integráció lehetősége intramuszkuláris injekció után” (Human Gene Therapy). Ez a korábbi tanulmány plazmid DNS IM-et tesztelt egerekben, és Southern blot hibridizációt és PCR-t használt nagy molekulatömegű genomiális DNS-en az integráció vizsgálatára. Bár a perzisztencia többnyire extrakromoszómális volt, egyes mintákban ritka integrációra utaló bizonyítékokról számoltak be (bár nem olyan véglegesen szekvenáltak, mint a későbbi munkákban). Ez a tanulmány alacsony kockázatúnak minősítette, de elismerte a nagyon alacsony gyakoriságú események lehetőségét, ami befolyásolta az FDA DNS-vakcinákkal kapcsolatos későbbi irányelveit.
Ledwith és munkatársai (2000) – „Plazmid DNS vakcinák: A gazdasejt DNS-ébe való integráció vizsgálata intramuszkuláris injekciót követően egerekben” (Intervirology). Az egerekbe intramuszkulárisan injektált csupasz plazmid DNS kimutatható integrációt mutatott, és bár nem figyeltek meg kimutatható integrációt, a DNS továbbra is kimutatható volt a négyfejű combizomban 26 hétig. A DNS extrakromoszómális volt.
7 A WHO Biológiai Szabványosítási Szakértői Bizottságának 74. jelentése, 3. melléklet. A hírvivő RNS-vakcinák minőségének, biztonságosságának és hatékonyságának értékelése a fertőző betegségek megelőzésében: szabályozási megfontolások https://cdn.who.int/media/docs/default-source/biologicals/vaccine-standardization/annex-3—mrna-vaccines_who_trs_1039_web-2.pdf
-
Dr. Charlotte Kuperwasser a Tufts Egyetem Orvostudományi Karának Fejlődésbiológiai, Molekuláris és Kémiai Biológiai Tanszékének elismert professzora, valamint a Tufts Egyetem Konvergencia Laboratóriumának igazgatója. Dr. Kuperwasser nemzetközileg elismert szakértelme az emlőbiológia, az emlőrák és a megelőzés területén. Tagja az Immunizációs Gyakorlatok Tanácsadó Bizottságának.
Mind hozzászólás
